3-4-1- RT-PCR37
3-4-2- تکثیر cDNA39
3-4-2-1- PCR(Polymerase Chain Reaction)39
3-4-2-2- مواد و وسایل مورد نیاز برای ساخت CDNA43
3-4-2-3- روش انجام آزمایش ساخت cDNA44
3-4-2-4- نحوه انجام واکنش RT-PCR برای اطمینان از صحت سنتز cDNA45
3-4-2-5- آشکار سازی محصولات PCR با الکتروفورز47
3-4-2-6- دستگاههای مورد نیاز برای الکتروفورز47
3-4-2-7- مواد لازم برای الکتروفورز47
3-4-2-8- نحوه انجام الکتروفورز48
3-4-2-9- آشکار سازی ژل48
3-5- Real time PCR49
3-5-1- موارد استفاده از Real-time PCR49
3-5-2- فازهای مختلف یک واکنش Real time PCR50
3-5-3- روش‌های سنجش با Real-time PCR51
3-5-3-1- روش غیر اختصاصی سنجش با Real-time PCR51
3-5-4- مفهوم Threshold وCt52
3-5-5- نحوه رسم منحنی ذوب (Melt Curve Analysis)53
3-5-6- نحوه انجام Real time PCR55
3-5-6-1- مواد لازم برای انجام Real time PCR55
3-5-6-2-روش انجام آزمایش Real time PCR55
3-5-6-3- آنالیز آماری 57
3-6-اندازه گیری ?-Amylase در سرم موش:57
3-6-1- جداسازی سرم از خون موش57
3-6-2- اندازه گیری ?-Amylase در سرم روش فتومتریک57
فصل چهارم نتایج60
4-1- مشاهدات افزایش وزن موش های گروه تست61
4-2- تعیین کیفیت و غلظت RNA استخراج شده66
4-3- بررسی کیفیت cDNA سنتز شده به وسیله PCR67
4-4-آنالیز منحنی ذوب (Melt Curve Analysis)68
4-4-1- مقایسه بیان ژن liver alpha amylase در موش های چاق و نرمال70
4-4-2-اثر چای سبز بر بیان ژن liver alpha amylase بر روی موش های چاق71
4-5- اندازه گیری آلفا آمیلازدر سرم به روش فتومتریک72
فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری73
5-1- بحث و نتیجه گیری74
5-2-پیشنهادات81
منابع83
خلاصه انگلیسی92
عنوان فهرست جداول صفحه
جدول 3-1-رژیم غذایی پر چرب29
جدول 3-2-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتز cDNA44
جدول 3-3-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتزcDNA44
جدول 3-4-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتز cDNA45
جدول 3-5-توالی پرایمرها برای تکثیر قطعه مورد نظر دارای ژن آلفا آمیلاز کبدی45
جدول 3-6 مواد لازم برای انجام واکنش RT PCR46
جدول 3-7-مواد لازم برای Real time PCR55
جدول 3-8-پرایمرهای مورد استفاده برای Real time PCR56
جدول 3-9-مقادیر لازم برای انجام تست سنجش آلفا آمیلاز59
جدول 4-1-تغییرات وزن موش ها تحت رژیم غذایی متفاوت61
جدول 4-2-میزان جذب نور توسط DNA در طول موج های 260 و 280 نانومتر67
عنوان فهرست نمودارها صفحه
نمودار 3-1-فازهای مختلف واکنش تکثیر51
نمودار 3-2-Cycle threshold&Threshold53
نمودار 3-3-منحنی ذوب54
نمودار 3-4-مراحل مختلف انجام واکنش Real time PCR56
نمودار 4-1-تغییرات وزن موش ها کنترل تیمار و کنترل عادی64
نمودار 4-2-تغییرات وزن موش ها کنترل تیمار و کنترل عادی64
نمودار 4-3-تغییرات وزن موش ها چاق تیمار و چاق عادی65
نمودار 4-4-تغییرات وزن موش ها چاق تیمار و چاق عادی65
نمودار 4-5-منحنی تکثیرژن آلفا آمیلاز کبدی69
نمودار 4-6-منحنی ذوب ژن آلفا آمیلاز کبدی69
نمودار 4-7-متوسط میزان تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی و کنترل عادی70
نمودار 4-8-متوسط میزان تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی و چاق کنترل71

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

نمودار 4-9-تغییرات آمیلاز در سرم موش های چاق و نرمال بر حسب IU/ml به روش فتومتریک72
عنوان فهرست اشکال صفحه
شکل2-1-نمایی شماتیک از آلفا آمیلاز یون کلسیم به رنگ خاکی و یون کلرید به رنگ سبز است11
شکل2-2-ساختار کریستالی آلفا آمیلاز جو ایزوآنزیم 116
شکل2-3-جایگاه ژن آمیلاز روی ژن 1p2117
شکل2-4-این شکل تکامل ژن آمیلاز انسانی را نشان می دهد19
شکل2-5-توالی ای که بعنوان عامل تفاوت در سایز بین mRAN آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی20
شکل2-6-مقایسه شماتیکی از mRAN آلفا آمیلاز کبدی و بزاقی21
شکل3-1-پلت آزمایشگاهی30
شکل3-2-مراحل خونگیری از قلب موش32
شکل3-3-مراحل جداسازی کبد موش33
شکل3-4- غلظت مواد استفاده شده در Master mix استفاده شده در PCR46
شکل3-5-اتصال SYBR به DNA52
شکل4-1-تصویر باند حاصل از RNA استخراج شده67
شکل4-2-صویر محصولات PCR چند نمونه که به صورت تصادفی انتخاب شده بودند68
فهرست اختصارات
VLN under limit normal
LTR long terminal repeat
NTE non translated exon
EGCG (-)-epigallocatechin-3-gallat
OD optical density
NTC no template control
PCR polymerase chain reaction
FRET fluorescence resonance energy transfer
CT cycle threshold
Tm melting temperature
HPRT hypoxanthine quinine phosphoribosyl transferase
WHO world health organization
چکیده:
مقدمه و اهداف
آلفا آمیلاز آنزیمی از راسته هیدرولازها است که پیوندهای 1به4 آلفا گلیکوزیدی در پلی ساکاریدها را کاتالیز می کند و یکی از مهمترین آنزیم های گوارشی است. استفاده از مهارکننده های آلفا آمیلاز (مانند چای سبز) می تواند در کنترل وزن مفید باشد، بنابراین مقایسه میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی بین موش های چاق و نرمال و تاثیر مهار کننده های آنزیم در میزان بیان ژن می تواند به مطالعات درمانی چاقی و سندرم متابولیک کمک نماید.
مواد و روش ها
موش ماده NMRI (6 هفته ای) به طور تصادفی به 4 گروه (8=n)تقسیم شدند. گروه اول موش های نرمال بودند که تحت هیچ تیماری قرار نگرفته بودند. گروه دوم موش های نرمال بودند که عصاره ی آبی الکلی چای سبز (به میزان 2/0 میلی گرم) مصرف کرده بودند. گروه سوم موش هایی بودند که رژیم غذایی پر کالری دریافت کرده بودند وگروه چهارم موش هایی بودند که علاوه بر این که رژیم غذایی پر کالری دریافت کرده بودند در این مدت از عصاره ی آبی الکلی چای سبز هم (به میزان 2/0 میلی گرم) دریافت کرده بودند. طی 8 هفته، در 4 گروه وزن بدن به صورت هفتگی اندازه گیری شدو پس از پایان دوره بافت کبدی جدا شده و بیان آلفا آمیلاز کبدی اندازه گیری شد. پس ازجداسازی RNA و سنتزcDNA،Real time -PCR با پرایمر اختصاصی برای ژن Amy-1 ژن انجام شد.

نتایج
متوسط تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی در مقایسه با موش های کنترل عادی افزایش یافته، و این افزایش از لحاظ آماری معنی دار است (P value?0.01).همچنین متوسط تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق تیمار در مقایسه موش های چاق عادی کاهش یافته، واین کاهش هم از لحاظ آماری معنی دار است ( P value?0.04). لذا می توان گفت مصرف هم زمان چای سبز با رژیم غذایی پر کالری اثر کاهنده بر روند افزایش بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی دارد.
واژه گان کلیدی : آلفا آمیلاز، کبد، بیان ژن، چاقی،چای سبز
فصل اول: کلیات
1-1-بیان مسئله
چاقی به عنوان یک خطر بزرگ برای سلامت انسان شناخته می شود. چاقی می تواند خطر ابتلا به بیماری های قلبی و عروقی (به طور عمده بیماری قلبی و سکته مغزی)، دیابت نوع 2، اختلالات اسکلتی عضلانی (به خصوص آرتروز) و انواع خاصی از سرطان (آندومتر، پستان و روده بزرگ) را افزایش دهد (74).
عموما کربوهیدرات ها یکی از اجزای اصلی تشکیل دهنده رژیم غذایی می باشند . کربوهیدرات ها قبل از اینکه توسط بدن جذب شوند باید به مونوساکاریدها شکسته شده باشند. این تجزیه با استفاده از دو آنزیم رخ می دهد: آمیلاز و گلوکوزیداز(55).
بنابر این جستجو برای یافتن مهار کننده قوی و کاربردی آلفا گلوکوزیداز و آلفا آمیلاز به عنوان ابزاری برای درمان چاقی مطرح شده و در حال حاضر تبدیل به کانونی برای پژوهش گردیده است.تا به حال مهار کننده های مختلفی برای آلفا آمیلاز شناسایی شده است که از آنها می توان به فلاونوئید ها اشاره کرد که از جمله آنها می توان به کاتچین ها اشاره کرد. کاتچین ماده موثره چای سبز می باشد (65). لذا احتمال دارد چای سبز نقش مهاری برای بیان ژن آلفا آمیلاز داشته باشد.
در این تحقیق قصد بر آن بوده است که از عصاره ی چای سبز به عنوان مهارکننده بالقوه بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش ها استفاده شود. استفاده از مهارکننده های آلفا آمیلاز(چای سبز) می تواند در کنترل وزن مفید باشد، بنابراین مقایسه میزان بیان ژن آلفا آمیلازکبدی بین موش های چاق و نرمال و تاثیر مهار کننده های آنزیم در میزان بیان ژن می تواند به مطالعات درمانی چاقی و سندرم متابولیک کمک نماید.
1-2-اهداف پژوهش
بررسی میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی به روش Real time PCR در بافت کبد موش های نرمال و چاق
– بررسی اثر چای سبز بر روند چاقی موش های چاق و نرمال
1-3-فرضیات اصلی پژوهش
– عصاره ی چای سبز اثر بازدارنده بر روند چاقی موش های چاق دارد.
– بیان ژن آلفا آمیلاز در کبد موش های چاق بیشتر از موش های نرمال است.
– بیان ژن آلفا آمیلاز در کبد موش های چاق تیمار شده با چای سبز نسبت به موش های چاق غیر تیمار کمتر است.
– بیان ژن آلفا آمیلاز در کبد موش های نرمال تیمار شده با چای سبز نسبت به موش های نرمال غیر تیمار کمتر است.
1-4- جنبه جدید بودن و نوآوری در تحقیق:
در کلیه مقالات مطالعه شده اثر چای سبز بر روی فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار گرفته است در صورتی که قصد این پژوهش مطالعه اثر عصاره ی آبی و متانولی چای سبز بر بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی به روش Real time PCR در موش چاق و نرمال است.
فصل دوم: مروری بر مطالعات گذشته
2-1-آمیلاز:
آمیلاز آنزیمی است که باعث تجزیه نشاسته به قند می باشد. آمیلاز موجود در بزاق انسان اولین فرآیند شیمیایی هضم را آغاز میکند. غذاهایی که حاوی مقادیر بالایی نشاسته اما قند بسیار کم هستند مانند برنج و سیب زمینی، هنگام جویده شدن در دهان، کمی طعم شیرین دارند زیرا آمیلاز در دهان نشاسته را به قند تبدیل می کند. همچنین آمیلاز موجود در پانکراس باعث می شود نشاسته موجود در رژیم غذایی به دی ساکارید ها و تری ساکاریدهای هیدرولیز شوند که توسط آنزیم های دیگر برای تامین انرژی بدن به گلوکز تبدیل می شود. گیاهان و برخی از باکتری ها نیز آمیلاز تولید می کنند (26).
2-1-1- تاریخچه:
لاچس در سال 1831، هیدرولیز نشاسته به آمیلاز را در بزاق به علت وجود آنزیمی در بزاق به نام ptyalin یا ماده تخمیری بزاق شرح داد (38). پایان و پرسوز شیمیدانان فرانسه در سال 1833 مجموعه آمیلاز را از جوانه جو جدا کردند و آن را “دیاستاز” نامیدند(53) و در سال 1862، جکولوویتچ آمیلاز پانکراس را شناسایی کرد (14).
2-1-2- آمیلاز در تکامل دستگاه گوارش انسان:
کربوهیدرات ها منبع غذایی غنی انرژی هستند. آمیلاز یک نقش کلیدی در تکامل دستگاه گوارش انسان داشته است چرا که امکان استفاده از یک جایگزین برای میوه و پروتئین را به انسان داده است. کپی برداری از ژن آمیلاز پانکراس به طور مستقل در انسان و جوندگان توسعه یافته است، که اهمیت بالای این آنزیم را نشان می دهد. سطح آمیلاز بزاقی که در تبار انسان یافت می شوند، شش تا هشت برابر بیشتر از شامپانزه است، که عمدتا میوه خوارند ونسبت به انسان کمتر مواد نشاسته ای مصرف می کنند(72).
2-1-3- کارکردهای آمیلاز :
آمیلاز موجب شکستن قندهای پیچیده از قبیل نشاسته موجود در آرد به قندهای ساده می شود. مخمر ها سپس بر روی این قندهای ساده واکنش انجام می دهند و آن را به الکل و CO2 تبدیل می کنند. این محصولات باعث افزایش عطر و طعم نان نسبت به برنج می شوند. در حالی که آمیلاز به طور طبیعی در سلول های مخمر یافت می شود، زمانی طول می کشد تا مخمر به میزان کافی از این آنزیم برای شکستن مقادیر قابل توجهی از نشاسته در نان ، تولید کند. یکی ازدلایل برای استفاده خمیر ترش در پخت نان همین موضوع است. درتکنیک های مدرن تولید نان از آمیلاز (که اغلب به صورت جو مالت شده است) به عنوان بهبود دهنده نان استفاده می کنند، تا فرآیند پخت نان برای استفاده تجاری سریع تر و عملی تر شود(44).
زمانی که آمیلاز به عنوان یک افزودنی غذایی استفاده می شود،) آمیلاز شماره (E1100، ممکن است از لوزالمعده خوکی یا قارچ مشتق شده باشد. آمیلاز باکتریایی 1 نیز درپودر لباس شویی و مواد شوینده ماشین ظرفشویی برای انحلال نشاسته از پارچه و ظروف استفاده می شود.
کارگران کارخانه که با آمیلاز برای هر یک از کاربردهای فوق کار می کنند، در معرض افزایش خطر ابتلا به آسم شغلی هستند. 5 تا 9 درصد نانوا ها تست پوستی مثبت درمورد آمیلاز دارند ، و یک سوم تا یک چهارم مشکلات تنفسی نانواها به خاطر حساسیت به آمیلاز است (43).
یکی از مهار کننده های آلفا آمیلاز به نام فاسئولامین2، به عنوان یک کمک کننده بالقوه در رژیم غذایی یافت شده است (69).
آمیلاز سرم خون ممکن است برای مقاصد تشخیص طبی اندازه گیری شود. غلظت طبیعی آن در محدوده (U/L101-21) است. وجود آمیلاز بالاتر از غلظت نرمال ممکن است منعکس کننده بیماری هایی نظیر التهاب حاد پانکراس (اگرهمزمان با لیپاز باشد مشخص تر است)(18)، زخم معده حاد، کیست تخمدان، انسداد روده کوچک و اوریون باشد. آمیلاز ممکن است در سایر مایعات بدن، از جمله ادرار و مایع صفاقی اندازه گیری شود(9).
در زیست شناسی مولکولی، حضور آمیلاز می تواند به عنوان یک روش کمکی دیگری برای انتخاب یکپارچه سازی موفق از سازه گزارشگر علاوه بر مقاومت به آنتی بیوتیک استفاده شود مناطق همولوگ از ژن ساختاری آمیلاز به عنوان ژن گزارشگر عمل می نمایند ،در صورت موفق بودن ادغام ژن مورد نظر ؛ ژن آلفا آمیلاز تخریب شده و از تجزیه نشاسته جلوگیری می شود که این امر به راحتی از طریق رنگ آمیزی ید قابل تشخیص است(9).
آمیلاز در بدن انسان در بزاق، آنزیمهای لوزالمعده و روده باریک یافت می شود. این آنزیم باعث تجزیه زنجیره های پلی ساکارید مانند نشاسته به اجزای کوچکتر و دی ساکاریدهایی مانند مالتوز می شود و نقش مهمی در هضم کربوهیدراتها دارد.سایر بافتها نیز تا حدودی فعالیت آمیلازی دارند که در این باره می توان به اندام هایی چون تخمدان ها ، روده کوچک و بزرگ و عضلات مخطط اشاره کرد(9).
آلفا آمیلاز موجود در بزاق کمی از نشاسته را تجزیه می کند چون مدت توقف غذا در دهان ناچیز است ولی قسمت عمده فعالیت این آنزیم مربوط به آمیلاز پانکراس است. آمیلاز به طورطبیعی از سلول های آسینار پانکراس به مجرای پانکراس وسپس دوازدهه ترشح می گردد و در روده به تجزیه نشاسته کمک می کند (9).
هضم نشاسته طی مراحل مختلفی در انسان انجام می شود. در ابتدا آلفاآمیلازهای بزاقی یک هضم جزئی انجام می دهند، که سبب شکستن نشاسته پلی مریک به الیگومرهای کوچکتر می شود. به محض اینکه این نشاسته کمی هضم شده به روده می رسد، توسط آلفاآمیلاز پانکراسی بطور گسترده ای به الیگوساکاریدهای کوچکتر هضم شده، به درون لومن ترشح می شود. مخلوط حاصل، از الیگوساکاریدها حاوی مالتوز، مالتوتریوز و تعدادی الیگو- گلوکانهای آلفا 1به4 و آلفا 1به6 می باشد. سپس این مخلوط از خلال لایه موکوسی به غشای پوشیده از میکروویلی سلولهای روده می رسد. در این نقطه تعدادی از آلفاگلوکوزیدازها تجزیه بیشتر این الیگوساکاریدها را تا به دست آمدن گلوکوز انجام خواهند داد. سپس این گلوکوز جذب شده، با یک سیستم انتقالی خاص وارد جریان خون می شود(61).
2-1-4- ساختار آمیلاز:
آمیلازها ساختاری پروتئینی دارند و به سه زیر گروه آلفا آمیلاز (?-Amylase) ، بتا آمیلاز (?-Amylase) و گاما آمیلاز (?-Amylase) تقسیم بندی می شوند. عمل هیدرولیز آلفا آمیلاز مرتب نبوده و در قسمت های مختلف زنجیره اثر می کند و بتا آمیلاز زنجیره های پلی ساکاریدی مانند نشاسته و گلیکوژن را از قسمت انتهایی احیا کننده ی آنها هیدرولیز می کند و هربار یک مولکول مالتوز به وجود می آورد و
گاما آمیلاز هم در واقع شبیه آلفا آمیلاز است ولی از نوع لیزوزمی آن که تفاوت اصلی آن با دو نوع دیگر آمیلاز کارآمدی آن در محیط های اسیدی است. دو ایزوآنزیم عمده آمیلاز مربوط به پانکراس (p) وغدد بزاقی (s) است. pH مطلوب برای این آنزیم حدود ? می باشد .یون های کلر، برم و نیترات آن را فعال وسیترات و اگزالات آن را مهار می کنند. در واقع آنزیم آمیلاز نشاسته رااز محل پیوندهای 1به4 هیدرولیز می کند. آن را به مالتوز تبدیل می کند(9).
2-1-5- اندازه گیری سطح خونی:
سطح خونی این آنزیم در آسیب سلولهای پانکراس در بیماری پانکراتیت و سایر بیماری های پانکراس مانند انسداد مجاری پانکراس در خون افزایش می یابد. بنابراین در موارد وجود علائم مربوط به بیماریهای پانکراس مانند درد شدید شکمی، تب، کاهش اشتها و استفراغ این تست درخواست می شود(9).
آسیب سلول های آسینار پانکراس ، التهاب یا انسداد در مجاری پانکراس یا مجرای صفراوی سبب برگشت آمیلاز به داخل بافت پانکراس می شود. سپس آمیلاز از طریق وریدچه ها وعروق لنفاوی جذب خون می گردد و سبب افزایش سطح آمیلاز در خون می شود. کلیه به سرعت آمیلاز را تصفیه می کند و در نتیجه سطح آمیلاز در ادار افزایش می یابد. سطح افزایش یافته ی آمیلاز در خون هیپرآمیلازی نامیده می شود. برای مثال در پانکراتیت حاد، مقدار آمیلاز سرم در مدت ??-? ساعت شروع به افزایش می کند در مدت ??-?? ساعت به اوج می رسد و در عرض ?-? روز به علت تصفیه آن توسط کلیه ها به وضعیت طبیعی می گردد. در واقع سطح آمیلاز سرم ?-? روز بعد از بهبود مرحله ی حاد بیماری به حد طبیعی برمی گردد اما در سطح آمیلاز ادرار ?-? روز پس آغاز بیماری بالا باقی می ماند این امر به تشخیص پانکراتیت پس از بازگشت سطح سرمی آن به حالت طبیعی کمک می کند. آزمون آمیلاز ادرار و سرم هر دو آزمون های حساسی هستند اما برای اختلالات پانکراس اختصاصی نیستند، سایر بیماری های غیر پانکراسی هم می توانند سطح آمیلاز را در سرم وادرار بالا ببرند. برای مثال در التهاب حاد غدد پاروتید مانند اوریون و نیز در انفارکتوس کلیه، بارداری خارج رحمی، انسداد روده، ایسکمی مزانتر و اختلالات وخیم روده ای هم مقدار آمیلاز افزایش می یابد پس باید علاوه بر آن آزمون ها به علایم بیماری هم توجه ویژه داشت(9).
در افراد مبتلا به موکوویسیدوز که یک بیماری مادر زادی پانکراس است سطوح آمیلاز سرم کاهش می یابد.افزایش آمیلاز خون به همراه کاهش یا نرمال بودن آمیلاز ادرار می تواند مطرح کننده اختلال در عملکرد کلیه و یا حضور ماکروآمیلاز (آمیلاز باند شده به پروتئینهای خون) در خون باشد که این وضعیت آخر نمی تواند مطرح کننده بیماری خاص باشد(9).
در پانکراتیت حاد معمولاً افزایش آمیلاز ، همسو با افزایش آنزیم دیگری به نام لیپاز می باشد و اغلب در تشخیص این بیماری اندازه گیری هر دو آنزیم با یکدیگر در خواست می شود ولی در پانکراتیت مزمن که معمولاً به دلیل الکلیسم و یا ناهنجاری های ژنتیکی مانند سیستیک فیبروزیس اتفاق می افتد میزان آمیلاز به صورت متوسط افزایش می یابد و یا در موارد آسیب و از بین رفتن سلولهای سازنده آمیلاز میزان این آنزیم کاهش می یابد.در اندازه گیری آمیلاز باید توجه داشت که داروهایی مانند آسپیرین، ضد بارداری های خوراکی، استروئیدها مانند کورتیکوستروئیدها، ایندومتاسین و همچنین داروهای مدر باعث افزایش آمیلاز می شود(9).
2-2- آلفا آمیلاز:
آلفا آمیلاز (EC 3.2.1.1) نوعی آنزیم است که اتصالات آلفای پلی ساکارید های بزرگ دارای پیوند آلفا، مانند نشاسته و گلیکوژن را به گلوکز و مالتوز هیدرولیز می کند(45). آلفا آمیلاز بیشترین فرم آمیلاز موجود در انسان ها و پستانداران می باشد. البته آلفا آمیلاز در بعضی دانه های گیاهی حاوی نشاسته حضور دارد و توسط بسیاری از قارچ ها هم ترشح می شود(71).
آلفا آمیلاز یک متالوآنزیم است که حداقل دارای یک یون Ca2+ می‌باشد و بدون حضور کلسیم نمی‌تواند به طور کامل فعال باشد. تعداد یون Ca2+ از یک تا ده متفاوت است(41). (شکل2-1)
3شکل 2- 1- نمایی شماتیک از آلفا آمیلاز یون کلسیم به رنگ خاکی و یون کلرید به رنگ سبز است.
2-2-1-کارکرد آلفاآمیلاز :
آلفاآمیلاز زنجیره کربوهیدراتی نشاسته را در مکان‌های تصادفی هیدرولیز کرده و تولید الیگوساکاریدهای کوتاه، مالتوز و گلوکز می‌کند. این واکنش بوسیله افزایش میزان قندهای احیا و کاهش رنگ آبی و یا از طریق تست برنفلد و تولید رنگ زرد قهوه‌ای در کمپلکس ید و نشاسته پایش می‌شود. براساس سیستم طبقه‌بندی که براساس شباهت توالی آمینو اسیدی طراحی شده است اکثر آنزیم‌های تجزیه کننده نشاسته از جمله آلفا آمیلازها در خانواذه ?? گلیکوزیل هیدرلازها قرار می‌گیرند. آلفا آمیلازها دارای چهار ناحیه حفاظت شده در توالی اولیه خود می‌باشند، برخی از این نواحی حفاظت شده مربوط به جایگاه فعال‌اند و برخی در پایداری ساختار سوم حفاظت شده نقش دارند. آلفا آمیلازها دارای یک ساختار8?/?))یا4 TIM barrel (بشکه?/?) می‌باشند. یک سری قوس‌های ?-?-? طوری آرایش می‌یابند که نتیجه آن ایجاد یک ساختمان پایدار می‌باشد، این موتیف را بشکه?/? می‌نامند(9).
آلفا آمیلاز یک آنزیم القاپذیر است که معمولاً در حضور نشاسته و محصولات هیدرولیزی نشاسته مانند مالتوز القا می‌شود. آلفا آمیلاز همانند سایر آنزیم‌های القاپذیر در حضور گلوکز و سایر قندها تحت تاثیر مهار کاتابولیک قرار می‌گیرد(9).
2-2-2- آلفا آمیلاز در فیزیولوژی انسان:
اگرچه آمیلاز در بسیاری از بافت های بدن یافت می شود اما عمدتا در بزاق و مایع پانکراس (لوزولمعده) به وفور یافت می شود که هر یک دارای ایزوفرم آلفا آمیلاز انسانی مخصوص خود می باشند. آنها در فشار ایزوالکتریکی رفتار های متفاوتی دارند ، و همچنین می توانند در آزمایش با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال جدا شوند. در انسان، همه ایزوفرم های آمیلاز مرتبط به کروموزوم 1p21 می باشند (67).
2-3- آمیلاز بزاقی یا ptyalin :
آمیلاز در بزاق یافت می شود و نشاسته را به مالتوز و دکسترین می شکند. این شکل از آمیلاز “ptyalin”یا “ماده تخمیری بزاق” نیز نامیده می شود(44). این آنزیم در بزاق مولکول های بزرگ و غیر حلال نشاسته را به نشاسته ی حلال (آمیلودکسترین، اریترودکسترین و آکرودکسترین) می شکند، که منجر به تولید قطعات کوچکتر از نشاسته و در نهایت مالتوز می گردد. Ptyalin بر اتصالات خطی ? 1)به(4 گلیکوزیدی عمل می کند اما هیدرولیز کامل ترکیب نیازمند آنزیم اثر کننده بر ترکیبات شاخه دار می باشد. آمیلاز بزاقی در معده توسط اسید معده غیر فعال می گردد. pH مایع معده حدود 3/3 است و ptyalin بمدت 20 دقیقه در درمای °C37 کاملا غیر فعال می شود(17).
2-3-1- تنوع ژنتیکی در آمیلاز بزاقی:
ژن آمیلاز بزاقی در طول تکامل تحت تکثیرقرار گرفته، و مطالعات هیبریداسیون DNA نشان می دهد که افراد بسیاری دارای چندین تکرار پشت سر هم ژن می باشند. تعداد کپی های این ژن مرتبط با میزان های آمیلاز بزاقی می باشند که با استفاده از تکنیک های وسترن بلاتینگ و آنتی بادی های مخصوص آمیلاز انسانی اندازه گیری شده اند(78).
2-4- آلفا آمیلاز پانکراس:
آلفا آمیلاز پانکراس به طور تصادفی اتصالات خطی ? 1)به(4 گلیکوزیدی آمیلوز را می شکند که نهایتا محصول آن دکسترین، مالتوز یا مالتوتریوز می باشد(9).
2-5- آلفا آمیلاز در پاتولوژی:
آزمایشات پزشکی معمولا هم آمیلاز پانکراسی و هم آمیلاز کل را اندازه گیری می کنند. انجام تست مربوط به بررسی آمیلاز در مقایسه با لیپاز آسان تر است.از آنجایی که میزان موجود این آنزیم در خون کم است، زمان تست هنگام گرفتن نمونه خونی برای این اندازه گیری بسیار حیاتی می باشد. خونگیری باید بلافاصله (سریعترین زمان ممکن) پس از درد پانکراسی گرفته شود در غیر این صورت به سرعت توسط کلیه ها دفع می شود.آلفا آمیلاز بزاقی به عنوان بیومارکری برای تشخیص استرس استفاده می شود که نیازی به خون گیری ندارد(9).
2-5-1- تفسیر میزان آلفا آمیلاز:
افزایش میزان پلاسمایی آلفا آمیلاز در انسان در موارد زیر یافت می شود:
ترومای بزاقی (شامل لوله گذاری بیهوشی)
اوریون – به دلیل التهاب غدد بزاقی
پانکراتیت – به دلیل صدمه به سلول های تولید آمیلاز
نارسایی کلیوی – به علت کاهش دفع
استرس
خواندن آمیلاز نهایی بالای 10 برابر از محدوده ی نرمال (ULN5) احتمالا به دلیل بیماری پانکراس یا پانکراتیتیس می باشد. 5 تا 10 برابر میزان طبیعی ممکن است نشان دهنده 6ایلئوس یا بیماری اثنی عشر و یا نارسایی کلیوی باشد، و میزان کمتر از نرمال، عموما در بیماری های غدد بزاقی یافت می شود (63و4و13).
2-6- بافر محدود کننده آلفا آمیلاز:
مولکول تریس به عنوان مهار کننده تعدادی از ?-آمیلاز های باکتریایی گزارش شده است(20و2)، از این رو بهتر است در زمان انجام مطالعه یا به کاربردن آنزیم از بافر تریس استفاده نشود.
2-7- مطالعه فعالیت آنزیم:
بسیاری از روشهای اندازه گیری فعالیت آلفا آمیلاز برای بررسی آنزیم موجود در مایعات بدن یا عصاره های برگرفته از دانه های گیاهی طراحی شده است.
روشهای رنگ سنجی بر اساس اندازه گیری رنگ آبی نشاسته – ید است که توسط فووا در دهه پنجاه میلادی ابداع شد تا آن زمان تمام متدهای اندازه گیری آمیلاز در یکی از این سه روش خلاصه می شد؛ یدومتریک، ساکاروژنیک و ویسکومتریک(19).
2-7-1- روشهای اندازه گیری فعالیت آلفاآمیلاز تا قبل از روش رنگ سنجی:
در روش یدومتریک ، فعالیت آمیلاز به صورت زمان لازم برای یک نمونه آنزیم مجهول جهت تبدیل سوبسترای بیرنگ از محلول آبی کمپکس نشاسته- ید، بیان می شود. این روش زیاد قابل اعتماد نبود زیرا غلظت آنزیم با کاهش رنگ رابطه خطی نداشت، همچنین رنگ آبی تحت تأثیر دما و عوامل دیگر پایداری خود را از دست می داد(73).
روش ساکاروژنیک بر اساس اندازه گیری گروههای احیاکننده تولید شده در اثر عمل هیدرولیز نشاسته طراحی شده بود. بنابراین با اندازه گیری قدرت کاهندگی محلول آنزیم – سوبسترا قبل و بعد از انکوباسیون، فعالیت آنزیم را اندازه می گرفتند. کاهندگی با استفاده از ترکیبات مس سنجیده می شد و به صورت میلی گرم گلوکوز آزاد شده بیان می شد(62). محدودیت آن، مداخله عوامل احیا کننده فرعی درمحیط بود که در سرم بیماران دیابتی کنترل این مسأله مشکل زا است و از طرفی آماده سازی سوبسترا نیز مشکل بود.
در روش ویسکومتریک که توسط دیویسون معرفی شد(15)، کاهش وزن مولکولی نشاسته که در ویسکوزیته محلول مؤثراست، اساس سنجش بود. این اندازه گیری در ویسکوزیمتر “استوالد” انجام می شد. زمان لازم برای کاهش ویسکوزیته تا بیست درصد، بیانی از فعالیت آنزیم بود (16).
زمان انکوباسیون حتماً متغیر بود زیرا سیالیت رابطه ای خطی با زمان ندارد؛ سرم حاوی آنزیم موردنظر، کمی ویسکوز است پس تداخل اجتناب ناپذیر بود (29).
2-7-2 – روشهای رنگ سنجی:
روشی که توسط فووا ابداع شده، خیلی استفاده می شود و بر اساس رنگ حاصل از اتصال ید با پلیمرهای نشاسته می باشد. در گزارشهای مختلف از محققان، اختلاف زیادی در غلظتهای استفاده شده ید ( از 3 میکرومول تا 25/0 میلی مول ) و طول موجهای مورد استفاده ( از 550 تا 700 نانومتر) دیده می شود. چون در این روش حجم نهایی باید به 20 تا 200 میلی لیتر برسد، برای تعداد زیاد نمونه مناسب نیست. بنابراین زیائو و همکارانش بر پایه همین واکنش نشاسته با کلر، روشی را در میکروپلیت ابداع کردند(76).
برنفلد (با استفاده از آمیلوپکتین سیب زمینی بعنوان سوبسترا و یک محلول دی نیتروسالیسیلیک اسید) روشی را برای اندازه گیری آلفاآمیلاز پانکراسی ابداع کرد که در آن فعالیت آنزیم توسط تعداد گروههای کاهنده ایجاد شده توسط آنزیم در طی هیدرولیز سوبسترا تعیین می شد (5). بعد از آن اصلاحاتی روی این روش انجام شد مثلاً کانو سوبسترا را به نشاسته محلول تغییر داد(33).
امروزه دو روش اصلی برای تعیین فعالیت این آنزیمها وجود دارد: یکی بر پایه اندازه گیری مقدار قندهای احیاکننده است که روش “دی نیتروسالیسیلیک اسید” و روش “نلسون – سوموگی” از این جمله اند(50) ، و روش دیگر همان روش “فووا” است (75).
2-8- معماری دمین های ساختار آلفا آمیلاز (Domain):
آلفا آمیلاز شامل تعدادی از دمینهای پروتئینی مجزا است. دمین عملکردی دارای یک ساختار شامل هشت رشته آلفا / بتا در هر بشکه است که شامل سایت فعال ، دمین متصل شونده به کلسیم می باشد(1). چندین آلفا آمیلاز دارای یک دمین صحفه بتا یا beta-sheet domain هستند، که معمولا در پایانه C است (32و31). این دومین به عنوان پنج رشته آنتی پارالل ورقه بتا دسته بندی می شود (42).(شکل2-2)

7
2-9- ژن های آلفا آمیلاز در انسان:
بزاقی: AMY1A, AMY1B, AMY1C
پانکراسی: AMY2A, AMY2B
آلفا آمیلاز پانکراسی توسط ژن های AMY-2A و AMY-2B و آلفا آمیلاز غدد بزاقی توسط ژن های AMY-1A وAMY-1B و AMY-1Cکد می شود که روی کروموزوم 1p21 واقع شده اند(24و22). (شکل2-3)
آلفا آمیلاز بزاقی و پانکراسی درجه بالایی از تشابه توالی اسیدهای آمینه را دارند. 97? شباهت در کل آنزیم و 92? در دمین کاتالیتیک دیده می شود (56و54).
تحقیقات نشان داده است که ژن آمیلاز غدد بزاقی در انسان تقریبا حدود kb10 است که دارای 11 اگزون و 10 اینترون می باشد که اندازه اگزون ها بین bp231-100 است (47).
8
1
ژن AMY-2B آلفا آمیلاز ی را کد می کند که توالی آمینو اسیدی آن بسیار مشابه با آمیلاز بزاقی(S) و پانکراسی(P) است که در بافت کارسینوئیدی ریه نیز بیان می شود. ژن AMY-2B به میزان کم در کبد انسان بیان می شود. در موش ، توالی رونوشت های P – آمیلاز به طور عمده متفاوت با آمیلاز موجود در غدد بزاقی و کبد است در حالی که رونوشت آمیلاز کبد در مقابل رونوشت S – آمیلاز فقط در انتهای توالی 5´ متفاوت است (8 و35). ژن کاذب -actin? در ناحیه بالا دست ژن AMY-2B واقع شده است. در همه ژن ها به جز AMY-2B ژن کاذب -actin? توسط عناصری شبه رتروویروسی درونی جدا شده است.
ژن های پانکراسی در مقایسه با AMY-2A شامل باقی مانده LTR9 سمت چپ است. وجود عناصر شبه رترو ویروسی داخلی در ارتباط با بیان آمیلاز در غدد بزاقی نشان می دهد که توالی رتروویروسی ممکن است در تنظیم توالی بزاقی شرکت داشته باشند (48). رونویسی از ژن های آمیلاز پانکراسی از اگزون a شروع می شود در حالی که رونویسی از ژن های آمیلاز غدد بزاقی از اگزون غیر ترجمه(NTE10) با ژن کاذب -actin?شروع می شود(23 و58). (شکل2-4)
2-10- آلفا آمیلاز در موش:
آلفا آمیلاز در موش ها توسط خانواده ای از ژن ها بر روی کروموزوم 3 (chr 3) بیان می شود (59).
AMY1 یک ژن تک نسخه ای است که در بیشتر گونه های موش بیان می شود. ناحیه AMY1 از دو پروموتور آلترناتیو در ناحیه بالادست ژن های ساختاری (kb5/4-5/7) رونویسی می شود. یکی از این پروموتورها در غده پاراتیروئید و دیگری در کبد و غده پاراتیروئید فعال است(36).
رونوشت های اولیه از این پروموتورها پیرایش می شوند و تولید mRNA هایی می کنند که فقط در ناحیه 5´ غیرترجمه شونده با هم متفاوت است(25).158 نوکلئوتید ناحیه انتهایی 5´mRNA آلفا آمیلاز کبدی با 47 نوکلئوتید انتهایی غده بزاقی متفاوت است.
تحقیقات نشان می دهد که mRNA آلفا آمیلاز در کبد و غده بزاقی از یک توالی DNA یکسان به طور متفاوتی در بافت های مختلف رونویس و پردازش می شوند. رونوشت های ژن AMY2 به طور اختصاصی در غده مترشحه پانکراس بیان می شود(60).
اما مطالعات نشان می دهد که بیان AMY2 به پانکراس محدود نمی شود و در سطح کم در سلول های کبدی بیان می شود(39).
2-10-1- تفاوت توالی انتهای 5´ mRNA های آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی موش از لحاظ اندازه:
هیبریدهای بین cDNA ژن آلفا آمیلاز غدد بزاقی و mRNA کبدی موش، در تمام طول 1600 نوکلئوتیدی cDNA در مقابل آنزیم نوکلئاز S1 مقاومت نشان داده است، بدین معنی که ممکن است محل توالی مسئول تفاوت توالی بین mRNA غدد بزاقی و کبدی درنتهای یک یا دو انتهای نوع کبدی قرار داشته باشد (36).
اتورادیو گرافی انجام شده که در شکل (2-5) مشاهده می شود نشان دهنده ی این است که توالی ای که بعنوان عامل تفاوت در سایز بین mRNA آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی شناخته می شود در انتهای 5´ قرار دارد. در شکل (2-5) استراتژی به کار رفته در جدا سازی قطعات انتهایی 5´ و3´ mRNA آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی، استفاده از Rnase Hمی باشد(25) .
11
12شکل 2-5- نمایش قرار گیری توالی ای که بعنوان عامل تفاوت در سایز بین mRAN آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی است.
2-10-2- مطالعات مربوط به آنالیز توالی mRNA آلفا آمیلاز کبدی:
برای تعیین توالی mRNA آلفا آمیلاز کبدی، استراتژی به کار رفته شامل آشکار سازی توالی cDNA آن بوده است(25).


پاسخ دهید